王晓，刁勇――重组人VEGF165蛋白在毕赤酵母中高效表达与多克隆抗体的制....doc

重组人 VEGF165 蛋白在毕赤酵母中高效表达 与多克隆抗体的制备 王晓 1,2，黄晓平 1,2，周宇 1,2，刁勇 1,2* （1：华侨大学分子药物研究院，福建 泉州 362021；2：华侨大学生物医学学院，福建 泉州 362021） 摘要：VEGF在大多数肿瘤中表达上调, 是肿瘤新生血管生成最重要的细胞因子，临床上VEGF的抗体可以 抑制肿瘤的发展。为深入研究VEGF165的生物活性及VEGF165抗体在肿瘤治疗中的作用，本文构建 pPIC9K-VEGF165分泌型载体，线性化后电击转化至GS115(his4)中，经MD平板筛选出阳性表达菌株并进行 PCR验证。菌株发酵上清液经Sephadex G-25，Heparin Sepharose FF和Sephacryl S-100层析介质分离纯化， 目的蛋白纯度达到95%，分子量约为24 KD。重组人VEGF165蛋白能够诱导HUVEC细胞增殖、提高HUVEC 细胞的活性。重组人VEGF165 蛋白免疫 小鼠，制 备多克隆抗体，间接ELISA法检测抗体效价达1： 51200 。重组人VEGF165蛋白的表达及多克隆抗体的成功制备为进一步探索VEGF165在肿瘤形成中的作用 以及VEGF165抗体治疗肿瘤的作用奠定了基础。 关键字： 重组人VEGF165蛋白；多克隆抗体；毕赤酵母； 中图分类号： 文献标志码：A High level expression of recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor 165 protein in Pichia pastoris and Preparation of VEGF165 Polyclonal Antibody Wang Xiao1,2，Huang Xiao-ping1,2，Zhou Yu1,2, Diao Yong1,2* （1:Institute of Molecular Medicine，Huaqiao University，Quanzhou 362021；2:School of Biomedical Sciences Huaqiao University， Quanzhou 362021） Abstract: As the single most potent angiogenesis factor, Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) were detected up-regulated expression in most tumors, and antibodies of which were shown to suppress tumor development clinically. In order to study the biological activity of VEGF165 and the effect of VEGF165 antibody 收稿日期： 通信作者：刁勇（1967 年），男，教授，主要从事新药研发、基因药物研究.E-mail: diaoyong@hqu.edu.cn 基金项目：国家自然基金 (No. 81271691)，国际科技合作项目 (No. 2011DFG33320)，福建省科技重大项目 (No. 2013N5007)，华侨大学校级基金 (No. 11HZR19) 资助。 in anti-tumor therapy, the recombinant secretory vector of pPIC9K-VEGF165 was constructed, linearized and then transformed into Pichia pastoris strain GS115 (his4) by electroporation. The positive transformants were seperated by MD plate screening and confirmed by PCR reaction. Subsequently, the rhVEGF165 protein was obtained by purification from the supernatant with Sephadex G-25 、Heparin Sepharose FF and Sephacryl S-100 gel filtration chromatograph with molecular weight of 24 kD and purity of 95%, showing by SDS-PAGE. Furthermore, the recombinant protein was found to have high potency of inducing HUVEC cell proliferation and improving HUVEC cell activity. The polyclonal antibody generated from rhVEGF165 immunized mouse exerts the titer of 1:51200 by indirect ELISA analysis. The successful expression of the recombinant human VEGF165 protein and preparation of VEGF165 polyclonal antibody lay the foundation for further exploration of VEGF165 role in tumor formation and VEGF165 antibody role in anti-cancer therapy. Key words: rhVEGF165 protein；polyclonal antibody；Pichia pastoris； 血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF) 又称血管通透因子，是血 管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可作用于血管内皮细胞，具有促进血管内皮细胞分 裂、增殖和调节血管的功能。最近研究表明，在大多数肿瘤中VEGF通过与其受体VEGFR相 互作用上调新生血管的生成，已经成为肿瘤新生血管生成中最重要的细胞因子。VEGF具有 5个亚型, 它们分别是VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189 和VEGF206[1] ，其中 VEGF165对肿瘤生长的影响最为重要。 近年来进入临床研究的药物大多数是通过抑制VEGF的活性来抑制肿瘤的生长，例如已 经上市的一种抗肿瘤药物——恩度，其抑制血管生成的机理就是与血管内皮细胞中的一些细 胞因子竞争性结合硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，从而阻断由生长因子引起的血管形成[2]，于是越 来越多的抗肿瘤药物都选择了VEGFR这一靶点。实验研究表明，VEGF的单抗能有效地抑制 肿瘤，特别是实体瘤的生长，已经开发为一种有效的抗肿瘤药物[3,4,5 ]。虽然针对VEGF的抗 体可以抑制肿瘤的发展，但因VEGF其他的亚型可能参与正常的生理功能，如减少血管内血 栓的形成及血栓性闭塞，抑制内膜增生等 [6] ，因此仅针对在肿瘤生长过程中最重要的 VEGF165而开发单克隆抗体将会减少不良反应的发生[7]。目前，制备多克隆抗体有抗原表位 预测、多肽合成、免疫动物等方法，如果根据抗原表位预测的方法制备抗体，必然会带来费 用高、工作量大的问题，而且重叠区之间的表位有可能被忽略，而不能够鉴定出目的蛋白上 所有的T细胞表位，目前VEGF165抗原表位还不是很明确，市售的VEGF165抗体均是根据全 长的VEGF165蛋白制备的。为了快速制备VEGF165多克隆抗体并用于后续实验，本文选择 利用纯化后的VEGF165蛋白直接免疫小鼠来获得多克隆抗体。 我们采用RT-PCR方法，从人肝细胞中克隆出VEGF165基因，构建了毕赤酵母分泌表达 型载体pPIC9K-VEGF165，通过G418筛选得到高表达菌株，经生物反应器高密度发酵，层析 介质纯化，得到纯度较高的重组人VEGF165蛋白，并对其促进血管内皮细胞活性、增殖进 行了初步验证，利用纯化的重组人VEGF165蛋白制备了多克隆抗体，为研制抗肿瘤的 VEGF165抗体奠定了基础。 1 材料与方法 1. 1 材料 1.1.1菌种、细胞株和质粒 E. coli DH5α、GS115（his4） 、pPCI9K均为生物医学学院保存、 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）购于美国典型菌种保藏中心（ATCC）。 1.1.2 实验动物 KM小鼠购于福建医科大学。 1.1.3 主要酶和试剂 限制性内切酶 Xho I 、Eco R I 、Stu I 购于宝生物大连有限公司。T4DNA 连接酶购于 Thermo Scientific 公司，D-生物素、D-山梨醇购于 Sigma 公司，无氨基酵母氮源购于 Amresco 公 司 ， DNA 凝 胶 回 收 试 剂 盒 、 质 粒 提 取 试 剂 盒 均 购 于 碧 云 天 公 司 。 Sephadex G-25 、 Heparin Sepharose FF、Sephacryl S-100 等层析介质均购于 GE Healthcare Life Sciences 公司， 鼠抗 VEGF 单抗，山羊抗鼠二抗均来自 Abcam 公司。 1.2 方法 1.2.1 VEGF165基因的扩增 根据GenBank中人HSPB7基因(XM_342966)的序列设计一对引物，上游引物为vP: 5’-ATA CTCGAGAAGAGAGCACCCATGGCAGAAGGAGG-3’，引入 Xho I酶切位点；下游引物为vF: 5’-CTCGAATTCTCACCGCCTCGGCTTGTCAC-3’，引入EcoR I 酶切位点，通过RT-PCR方 法从人肝细胞中提取总RNA，然后反转录成cDNA，以cDNA为模板，用Pyrobest DNA聚合 酶进行特异性扩增。 1.2.2 重组表达载体的构建与鉴定 PCR产物进行凝胶回收，回收的VEGF165基因与pPIC9K质粒分别进行Xho I和EcoR I酶 切，T4连接酶连接回收后的目的片段，连接产物转化DH5α感受态细胞，通过氨苄(1mg/ml) 抗性筛选出阳性克隆，提取质粒并经PCR和酶切鉴定。委托金斯瑞科技有限公司对重组质粒 进行测序分析。 1.2.3 GS115-VEGF165工程菌株的构建与鉴定 pPIC9K-VEGF165表达载体经Stu I线性化、电转化至感受态的毕赤酵母GS115(his4)， 涂布含G418的MD平板来筛选高拷贝的转化子。待菌落长出，挑取单克隆菌株进行PCR鉴定。 将PCR结果为阳性的克隆按照文献[8]中的方法进行诱导表达。利用VEGF ELISA方法测定发 酵上清液中VEGF165的表达量，并将发酵上清液经SDS-PAGE分离，电转至PVDF膜上，5% BSA封闭2 h，室温孵育鼠抗VEGF抗体2 h，PBST（PBS+0.5% tween 20）漂洗3次，每次10 min，室温孵育山羊抗鼠抗体2 h，PBST漂洗3次，最后使用HRP底物ECL检测，Bio-Rad凝胶 成像系统进行成像。 1.2.4 重组人VEGF165蛋白分离纯化 发酵上清液经 Sephadex G-25 凝胶过滤层析、Heparin Sepharose FF 肝素亲和层析、 Sephacryl S-100 凝胶过滤层析, 得到重组人 VEGF165 蛋白，进行 SDS-PAGE 电泳。利用 Quantity One 软件对蛋白电泳图片进行分析，计算出目的蛋白占总蛋白的百分比，得出目的 蛋白纯度。 1.2.5 重组人 VEGF165 蛋白对 HUVEC 活力的影响 取对数生长期的 HUVEC 细胞，以 5000 个/孔的密度接种至 96 孔板，待细胞贴壁后加 入重组人 VEGF165 蛋白，至终浓度分别为 12.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml ，对照组加入等体积的生理盐水。37℃ 5% CO2 条件下继续培养 48 h，每孔加 10 μl MTT(5 mg/ml)培养 2 h，再加 200 μl DMSO 溶解，酶标仪检测 490 nm 处的吸光值，计算细 胞存活率。 1.2.6 重组人 VEGF165 蛋白对 HUVEC 增殖的影响 Edu 是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶渗入正在复制的 DNA 分子中，能快速检测细胞 DNA 复制活性及高效快速地检测细胞增殖。取对数生长期 的 HUVEC 以 5000 个/孔的密度接种至 96 孔板，加入重组人 VEGF165 蛋白，至终浓度分别 为 25 ng/ml、200 ng/ml，对照组加入等体积的生理盐水，37℃ 5% CO2 条件下继续培养 48h。再加入 Edu 孵育 2 h，弃培养基、固定细胞、洗涤、Hochest 33258 复染、洗涤后进行 拍照，利用 Image pro-Plus6.0 软件分别对 Edu 阳性细胞（新增殖的细胞）和 Hochest 33258 阳性细胞（所有细胞）进行计数，最后统计分析新增殖细胞占总细胞数目的百分比。 1.2.7 VEGF165 多克隆抗体的制备 0. 1mL纯化的重组人VEGF165蛋白(1 mg/mL)与0.1mL弗氏完全佐剂混匀后，肌肉注射 小鼠腋下和腹股沟处进行初次免疫。此后每隔1周进行1次免疫，共3次，最后采用0. 1ml重 组人VEGF165蛋白(1 mg/ml)与0. 1 mL弗氏不完全佐剂混合液进行免疫， 1周后采取眼球取血， 分离血清，测定多克隆抗体效价。 1.2.8 多克隆抗体效价的测定 用纯化的重组人VEGF165蛋白(50 μg/ mL) 100 μL/孔室温包被酶标板过夜，PBST(0. 01 mol/ L PBS、0. 5 % Tween20)洗涤5次；加150 μL 1% BSA 37℃封闭1 h，洗涤5次后依次加入 小鼠免疫血清（以未进行免疫的正常小鼠血清作为阴性对照）孵育2 h、PBST洗涤5次；加 入HRP标记的山羊抗小鼠二抗孵育2 h 、PBST洗涤5次；加入底物TMB室温显色15 min，2 N 硫酸终止，酶标仪测定吸光值。按照文献[9]中的方法计算抗体效价。 2、结果 2.1 重组表达质粒（pPIC9K-VEGF165）的构建与鉴定 重组表达质粒 pPIC9K-VEGF165 的酶切图谱显示，经 EcoR I 与 Xho I 双酶切后出现 了与 VEGF165 目的基因大小相同的条带，约 500bp（图 1）。基因测序的结果进一步证实 pPIC9K-VEGF165 重组质粒构建成功。 图1. pPIC9K-VEGF165重组质粒的鉴定 Fig.1 Identification of recombinant vector pPIC9K-VEGF165 M: DNA ladder; 1: VEGF165 DNA; 2: PCR products of E. coli DH5α/pPIC9K-VEGF165; 3: pPIC9K-VEGF165 digested with EcoR I; 4: pPIC9K-VEGF165 digested with EcoR I and Xho I 2.2 重组人 VEGF165 蛋白的表达与鉴定 重组质粒pPIC9K-VEGF165电转化至GS115(his4)，涂布含有G418的MD平板，筛选出髙 拷贝的单菌落，单菌落PCR扩增片段为500bp（图2）。按照文献中报道的方法，阳性克隆进 行生物反应器发酵[8] ，ELISA测得发酵上清液中重组人VEGF165蛋白表达量达230 mg/L。 Western blotting结果显示，转染了重组质粒的工程菌能检测到VEGF165阳性条带的存在，而 未转染重组质粒的菌落未能检测到VEGF165阳性条带（图3）。 图2.GS115(His4) 阳性转化子菌落PCR鉴定 Fig2. Identification of GS115 (His4) positive transformants by colony PCR M: DNA ladder; 1:VEGF165 DNA; 2-4: PCR products of GS115/pPIC9K-VEGF165; 5: PCR products of GS115/pPIC9K 图3.重组人VEGF165蛋白Western blotting 鉴定 Fig3. Western blotting analysis of rhVEGF165 protein Lane 1: GS115/pPIC9K fermentation supernatant; Lane 2: GS115/pPIC9K-VEGF165 fermentation supernatant. 2.3 重组人 VEGF165 蛋白的纯化 重组人VEGF165蛋白的分离纯化包括硫酸铵预处理以及后续的三步凝胶层析。预处理 后的上清液经过Sephadex G-25凝胶层析，用20 mmol/L pH 6.0Tris-HCl平衡缓冲液洗脱，洗 脱液经Heparin Sepharose FF肝素亲和层析，分别用0.1 mol/L、0.3 mol/L、0.5 mol/L NaCl溶 液 (由pH 6.0、20 mmol/L的Tris-HCl 配制）洗脱，洗脱液过Sephacryl S-100凝胶过滤层析， 平衡缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH 6.0）洗脱峰即为重组人VEGFl65蛋白（图4）。最终的 重组人VEGF165蛋白进行SDS-PAGE电泳，图片经过Quantity one 软件分析，得出重组人 VEGF165蛋白纯度约为95%，超滤浓缩至浓度为1 mg/mL备用。 图4. 重组人VEGF165蛋白纯化的SDS-PAGE分析 Fig4. rhVEGF165 protein products analysis by SDS-PAGE Lane 1:Protein ladder ; Lane 2 : Fermentation supernatant of GS115/pPIC9K ; Lane 3 : Fermentation supernatant of GS115/pPIC9K –VEGF165；Lane 4: The washing protein with 0.1 mol·L-1 NaCl after heparin-affinity column; Lane 5: The washing protein with 0.3 mol·L-1 NaCl after heparin-affinity column; Lane 6: The eluting protein with 0.5 mol·L-1NaCl after heparin-affinity column; Lane7: Fractions containing rhVEGF165 after Sephacryl S-100 column. 2.4 重组人 VEGF165 蛋白对 HUVEC 活力的影响 取对数生长期的HUVEC细胞，以5000个/孔的细胞密度接种至96孔板，培养12 h后加入 不同浓度的重组人VEGF165蛋白，继续培养48h。MTT法检测结果显示，重组人VEGF165蛋 白对HUVEC细胞活力的提高表现出量效关系（图5），200 ng/ml组的HUVEC存活率为 130.7%+9.4%，100 ng/ml组的HUVEC存活率为128.5%+8.6%，50 ng/ml 组的HUVEC存活率 为116.6%+7.9%。 图 5. 重组人 VEGF165 蛋白对 HUVEC 细胞活力的影响 Fig.5 Effects of rhVEGF165 protein on HUVEC cells activity. Data were presented as mean±SD (n = 6).*P < 0.05 vs. control group and **P < 0.01 vs. control group. 2.5 重组人 VEGF165 蛋白对 HUVEC 细胞增殖的影响 HUVEC细胞膜表面含有VEGF的受体VEGFR，VEGF与其受体结合，能够诱导VEGFR 的磷酸化，从而启动下游细胞增殖的信号通路。利用Edu染色方法检测重组人VEGF165蛋白 对HUVEC细胞增殖的影响结果见图6 A。利用Image pro-Plus6.0软件分别计算新增殖的细胞 （Edu染色阳性）数目与总细胞（Hoechst染色阳性）数目，然后统计细胞增殖率。对照组的 细胞增殖率为18.7%，25 ng/ml 重组人VEGF165蛋白组为33.49%，200 ng/ml重组人VEGF165 蛋白组为44.5%（图 6 B）。以上结果说明，我们得到的重组人VEGF165蛋白具有诱导 HUVEC细胞增殖的活性。 图6 重组人VEGF165蛋白对HUVEC细胞增殖的影响 Fig.6 Effects of rhVEGF165 protein on HUVEC cells proliferation. A: Proliferating HUVEC cells were labeled with EdU. The Click-it reaction revealed EdU staining (red). Cell nuclei were stained with Hoechst 33342 (blue). The images are representative of the results obtained.B:The percentage of EdU-positive HUVEC cells were quantified. Data were presented as mean±SD (n = 6). **P < 0.01 vs. control group. 2.6 VEGF165 多克隆抗体效价测定 以纯化后的重组人 VEGF165 蛋白作为抗原包被酶标板，间接 ELISA 法测得多克隆抗 体的效价为 1：51200，免疫滴定曲线见图 7。 图7 ELISA法测定多克隆抗体VEGF165效价 Fig7. Determination of polyclonal antibodies VEGF165 titer by ELISA 3.讨论 肿瘤血管生成为肿瘤组织提供氧气和营养物质，同时血管又是肿瘤发生转移的途径，新 生血管通过旁分泌和“灌注”效应方式促进肿瘤生长。因此抑制肿瘤血管的新生，可以抑制 肿瘤的生长和转移。VEGF可以与血管内皮细胞上的特异性受体相作用，有效地刺激内皮细 胞增殖、调控血管生成[10-11]，是肿瘤血管新生最重要的细胞因子。鉴于VEGF重要的生理和 病理作用，需要大量具有高度生物学活性的VEGF供实验室和临床研究。然而，天然VEGF 由于具有来源有限、产量甚微、价格昂贵等缺点，远不能满足需求，因此，利用基因重组技 术生产大量的VEGF势在必行。常用的大肠杆菌表达系统所得到的重组人VEGF165蛋白，具 有不能进行糖基化等翻译后的修饰，生物学活性受到影响的不足[12]；哺乳动物细胞所表达 的重组人VEGF165蛋白，表达量很低。而酵母作为一种新型外源基因的表达系统，既具有 原核细胞良好的可操作性，又可以进行真核系统翻译后加工，是外源基因表达的理想宿主 [13]。 本文通过毕赤酵母表达系统，成功地表达了重组人VEGF165蛋白，蛋白表达量较高，达 到230 mg/L。由于我们利用G418加压筛选得到了高表达菌株，并且采用了生物反应器高密 度发酵，所以本课题筛选得到的菌株表达量要比文献[14]中报道的要高10倍。由于毕赤酵母 自身分泌表达的蛋白较少，利于进行下游纯化，并且能对VEGF165蛋白进行适度地糖基化， 表达的重组人VEGF165蛋白经过G-25脱盐、肝素亲和层析和S-100凝胶层析后即得到分子量 为24 KD、纯度达95%的目的蛋白。 本实验对表达纯化的重组人VEGF165蛋白生物进行活性分析，结果为 200 µg/L蛋白组 的HUVEC细胞存活率为130.7%+9.4%，Edu法结果显示重组人VEGF165蛋白能促进HUVEC 的增殖，与马骊等报道一致[13]。 商品名为Avastin 的贝伐单抗( Bevacizumab)于2004年2月26日获得FDA的批准，是美国 第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药物。贝伐单抗是VEGF 的人源化单克隆抗体， 其中93%是人IgG 骨架，7% 是鼠源结合区域[15]，可阻止VEGF 与VEGFR1 和VEGFR2 结 合，与标准化疗方案联用，可抑制肿瘤新生血管的形成和生长，显著提高生存率，延长患者 的生存期，并且不易产生抗药性[16-17]。研究发现Avastin主要和VEGF家族中的VEGF-A结合， 而不能中和VEGF-B和VEGF-C，使得其疗效非常有限[18]。因此，开发新的VEGF抗体非常有 必要。本文分离纯化的重组人VEGF165蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体，通过间接ELISA法测 得所制备的多克隆抗体效价约为1:51200，多克隆抗体的成功制备为VEGF165抗体运用于肿 瘤的治疗奠定了基础。 参考文献 [1] Brown L F, DetmarM, Claffey K, et al. 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